PÁSZTÁZÓ ERÔMÉRÉSES MIKROSZKÓPIA

Tartalom

 Bevezetés

Éppen tíz évvel ezelôtt Gerd Binnig és Heinrich Rohrer kapta meg a fizikai Nobel díjat, mégpedig a pásztázó alagútáram mikroszkópia kifejlesztéséért. A pásztázó alagút mikroszkóp (Scanning Tunneling Microscope, STM) mûködésének elve dióhéjban a következô: egy igen hegyes tû végigpásztázza a vizsgálandó felszínt attól néhány Å-nyi távolságban, miközben a tû és a minta között az alagút effektus miatt elektromos áram folyik. Ezt folyamatosan mérve számítógép segítségével megkapható a felület topográfiája - akár atomi felbontásban is.
Binnigék az STM kifejlesztése után szinte azonnal rájöttek, hogy az alagútáram mérése helyettesíthetô a tû és a felület között ébredô lokális erô mérésével. Így jutottak el a pásztázó erôméréses mikroszkóp, az AFM (Atomic Force Microscope) feltalálásához. A jegyzetben az AFM elvi felépítésérôl, a különbözô mérési eljárások alapelveirôl, problémáiról lesz szó.
 

Az AFM felépítése, mûködési elve

Bár a technikai megvalósítás sokféleképpen történhet, a mikroszkóp fôbb részei minden esetben a következôk:
- egy laprugón lévô hegyes tû
- a rugó deformációját érzékelô rendszer (detektor)
- visszacsatoló-vezérlô rendszer
- mozgató-rendszer (általában piezoelektromos)
- adatfeldolgozó rendszer
 
 
  1.ábra Az AFM elvi felépítése  
 

Mérôrugók, mérôtûk
 

A tû és a rugó mechanikai tulajdonságai nagyban befolyásolják a mikroszkóp felbontóképességét. A mérôrugóknak két feltételnek kell megfelelniük:
1. A nagy érzékenység eléréséhez a rugóállandónak kicsinek kell lennie. A mérési eljárásoktól függôen 0.001 N/m-tôl akár 35 N/m-ig változhat a kereskedelemben elérhetô rugók rugóállandója.
2. A környezetbôl érkezô zavaró, általában viszonylag kis frekvenciájú rezgések és a visszacsatolási elektronika miatt fontos, hogy nagy legyen a rugó rezonancia-frekvenciája (a kereskedelemben kapható rugók rezonancia-frekvenciája 15 - 500 kHz-ig terjed).
Természetesen ezeket a követelményeket nem könnyû egyszerre teljesíteni. Ha figyelembe vesszük, hogy a rugó-tû rendszer f₀ rezonancia-frekvenciájára és k rugóállandójára fennáll az



összefüggés, akkor látható, hogy a két feltétel akkor teljesül egyszerre, ha az m₀ effektív tömeg kicsi. A mérési metodikák tárgyalásánál még visszatérünk arra, hogy mikor milyen mérôrugót célszerû használni. Binnigék például egy kézzel készített rugót használtak, ami aranyfóliából készült, 1 mm hosszúságú volt, és a végére egy kis gyémánttût ragasztottak. Késôbb a szilícium, szilícium-oxid, szilícium-nitrid alapanyagú mérôrugók terjedtek el. Tipikus hosszúságuk 100 µm, vastagságuk 1 µm, felülnézetben téglalap vagy V-alakúak. A mérôrugók általában integrált tûvel készülnek, fotolitográfiás technikával. A tûk végleges alakjukat elektrokémiai maratással nyerik el. A "tövüknél" kb. 5 µm átmérôjûek, míg a csúcsuknál kevesebb, mint 500 Å a görbületi sugaruk.
Aleggyakrabban hasznalt  mérôrugók V-alakú volt, 200 µm szárhosszúsággal és 18 µm vastagsággal. A rezonancia-frekvencia 5-15 kHz , a rugóállandó 0.0032 N/m volt. A rugó és a tû anyaga Si₃Ni₄, a tû görbületi sugara kisebb 100 Å-nél (ún. "supertip").
 

Detektálási rendszer
 

A detektálási rendszer feladata nem más, mint a mérôrugó elmozdulásának érzékelése.  Ennek leggyakoribb módja  a fény-reflexiós detektálási módszer (ezen az elven mûködik az általunk használt berendezés is). Ennek lényege az, hogy a mérôrugóra irányított és arról visszaverôdô vékony fénynyaláb segítségével érzékelhetô a rugó deformációja. A legmegfelelôbb fényforrás természetesen a lézer. Egy ilyen detektálási elrendezés vázlata látható a 2-es ábrán:
 
 
 

2. ábra A detektálási rendszer vázlata  
 

A lézernyaláb elmozdulását kettô- vagy négyszegmensû osztott-diódás detektor érzékeli. A mérés elkezdése elôtt a lézer-dióda, a tükör és a detektor mozgatásával el kell érni, hogy a visszavert nyaláb éppen a detektor közepére essen. Ekkor a szegmensek áramainak összege maximális, a szemben lévô szegmensek áramainak különbsége pedig nulla. A jel-zaj viszony nagymértékben függ a reflektáló felület minôségétôl. Arra is érdemes odafigyelni, hogy a lézer lehetôleg a laprugó legvégérôl verôdjön vissza, hiszen ott maximális a rugó kitérése.
 

Mozgató-rendszer
 

A mozgató-rendszer feladata a minta és a tû egymáshoz viszonyított (relatív) mozgatása, megfelelô pontossággal. Ez piezoelektromos kristályok segítségével történik. (Többek között ezen anyagok létezése tette lehetôvé az STM és az AFM kifejlesztését.) Több féle geometriai elrendezés létezik. Az egyik esetben a minta x-y irányú mozgatását és a tû z irányú mozgatását két különálló piezo kristály végzi. A másik esetben a minta nem mozog, csak a tû (az általunk használt Topometrix AFM is ilyen). Ez utóbbinak is két megvalósítása lehetséges. Az úgynevezett tripod scanner x-y-z irányban lineárisan deformálódik. Ezt viszonylag nagyobb tartományok (1-100 µm oldalhosszúságú négyzet) pásztázására használjuk. Az ún. tube scanner négy szegmensbôl álló henger alakú kristály, amelyet a palást négy átellenes pontján illetve a henger belsejében elhelyezett elektródák vezérelnek. Ezzel a megoldással az összes szükséges mozgás elérhetô. Igazán nagy felbontás ezzel a változattal érhetô el, viszont nagyobb tartomány pásztázására kevésbé alkalmas (ez utóbbi állítás a Topometrix gyártmányú mikroszkópra igaz). Egy jó minôségû scanner segítségével akár 0.1 Å z-irányú felbontás is elérhetô.
A pásztázás elkezdése elôtt természetesen a tût a mintához közel kell vinni. Ez részben manuálisan, részben egy léptetômotor segítségével történik. Az utolsó tized-millimétereken a közelítés automatikus, a léptetômotor vezérlését ilyenkor a számítógép veszi át.
 

Mûködési elv, mérési metodikák
 

Az eddigiekben szó esett az AFM felépítésérôl, arról, hogy miképpen történik a mérôtût hordozó laprugó deformációjának érzékelése, a tû és a minta egymáshoz képest történô precíz mozgatása. Mindezen ismeretek birtokában vizsgáljuk most meg, hogy mi történik a minta és a tû között, és hogy hogyan lehet mindebbôl képet készíteni a minta felszínérôl.
A minta és a mérôtû között ébredô erô sokféle tagból tevôdhet össze: lehet van der Waals erô, lehet elektrosztatikus és mágneses kölcsönhatás, a Pauli-elvbôl és a kicserélôdési kölcsönhatásból származó erôk, és egyéb kölcsönhatások, attól is függôen, hogy milyen a tû illetve a minta anyaga.
 
 
 

A felszín és a tû közötti potenciál

 
 
 

A felszínhez közelítve a tûre elôször vonzó erô hat, ami taszítóvá válik - kellôen közel kerülve a mintához.
Ha ábrázoljuk az erõ változását a távolság függvényében, akkor láthatjuk, hogy  elöszõr a tû és a felület között fellépõ erõk azok vonzó erõk, amelyek taszítóvá válnak. Ahol az erõgörbe a tengelyt metszi, ott éri el a tû a felületet.
Az erô mérése kétféleképpen történhet:

a) Nem modulált vagy DC eljárás

Ez az eljárás az erôt a mérôrugó elhajlásának detektálásával méri. A mérôrugó függôleges kitérése a Hooke-törvény szerint arányos a rá ható erôvel: F = kz.
Ha a rugó a felszín felett haladva a változó erô hatására elhajlik, a visszacsatoló elektronika úgy módosítja a piezo z irányú deformációját, hogy a rugó az eredeti állapotába visszatérjen. (A visszacsatoló elektronika gyorsasága  felsô határt  szab a pásztázási frekvenciának.) Ezáltal felvehetô a z irányú piezo-feszültség V_z(x,y) függvénye, ami megfelel a felület topográfiájának, feltéve, hogy a tûre ható erô csak a tû és a felszín közötti távolságtól függ (az esetek nagy részében ez fennáll).

b) Modulált vagy AC eljárás

Egy piezoelektromos kristály segítségével a laprugót a rezonancia-frekvenciája környékén rezgésbe hozzuk, és a tûre ható erô változására fellépô rezonancia-frekvencia eltolódást detektáljuk. Ez a technika az erô gradiensére érzékeny, ami az effektív rugóállandót változtatja. Megmutatható, hogy a tû és a minta közötti vonzó erô csökkenti, a taszító erô növeli a rezonancia-frekvencia értékét.

A mérési metodikák a tû és a minta egymáshoz viszonyított helyzete szerint is csoportosíthatók:

1. "Contact" mérési eljárás

A tû és a minta állandó kontaktusban vannak. Ilyenkor a tû a taszító tartományban "dolgozik" . A k rugóállandót az érzékenység növelése érdekében kicsire célszerû venni, azaz lágy mérôrugót kell használni. A felszínen levô szennyezôdés, lecsapódott pára miatt fellépô meniszkusz erô az egyik legzavaróbb effektus, de csökkenthetô hegyesebb tû használatával, vagy megszüntethetô folyadék alatt történô méréssel (errôl még lesz szó).
- Állandó erôvel történô mérés
A visszacsatoló rendszer a DC eljárásnál leírtak szerint mûködve az erôt állandó értéken tartja, a piezo kristály z irányú feszültsége úgy módosul, hogy az "követi" a felszín hullámzását. Az osztottdiódás detektoron a fényfolt helyzete így állandó marad. Ez a legelterjedtebb mérési eljárás.
- Változó erôvel történô mérés
Itt a piezo kristály z irányú feszültsége állandó, a mérôrugó változó erô miatt bekövetkezô deformációját detektáljuk folyamatosan. A detektor nem képes olyan mértékben követni a kitéréseket, mint az elôzô eljárásnál a piezo, ezért ez kevésbé elterjedt technika.
- Lokális erô spektroszkópia
A felület egy kiválasztott pontján felvesszük az erô - elmozdulás függvényt, ahol az  elmozdulás alatt a piezo z irányú deformációját kell érteni, az erôt pedig a rugó elhajlásából kapjuk meg. A 4.ábrán egy tipikus görbe látható, valamint az, hogy a mérések során milyen alakváltozásokat szenved a mérõrugó.
        a: Az az intervallum amikor a tût a piezo közelíti a felülethez. Ha ebben a tartományban hosszú távú taszító/vonzó erõt érzékel a tû akkor a mérõrugó el fog hajlani. Ebben az adott esetben nem lépnek fel ezek az erõk, így a rugólapka nem szenved alakváltozást.
        b: Mihelyt a tû elérte a felszínt, a lapka alakváltozása egyre nõni fog, miközben a rugólapka rögzitett vége mind közelebb kerül a felülethez. Ha a rugólapka elég merev, a tû mélyen bele fog vágni a mintába. Ebben az esetben a görbe alakja, meredeksége információt szolgáltat a minta kémiai és mechanikai tulajdonságairól.
        c: Ez az a pillanat amikor kezdjük kihúzni a tût.
        d: Az adhézió/kötés megszakadása az  erõmérés legfontosabb pontja. Ilyenkor a tû szabaddá válik. Ezt tudjuk felhasználni arra, hogy meghatározzuk azt az erõt amely szükséges ahhoz, hogy egy adott kötést vagy adhéziót elszakítsunk.

4.ábra Egy tipikus erô-kalibráció görbe

 
 
 

2. "Noncontact" mérési eljárás

Itt az erô mérése az AC eljárásnál leírtaknak megfelelôen történik. A visszacsatolást vagy konstans amplitúdó vagy konstans frekvencia mellett végzik. Ezzel nem érhetô el akkora felbontás, mint a contact eljárással, viszont a mintát kevésbé rongálja.
- Nagy amplitúdójú rezonancia
A merev laprugó (k nagy) a rezonancia-frekvenciáján rezeg (50-500 kHz), nagy amplitúdóval (100-1000 Å). A tû fôleg a vonzó tartományban mûködik, de "behatolhat" a taszító tartományba is. Nagyon lágy minták esetében használjuk.
- Kis amplitúdójú rezonancia
Ez is nagy rugóállandóval, de kis amplitúdóval (2-10 Å) mûködô technika. Érzékeny a felületet borító szennyezôdésre.
- DC Noncontact
Ez esetben nem rezegtetjük a rugót, de a taszító tartománynál jóval távolabb tartjuk a tût. A szennyezô réteg hatása itt jóval nagyobb, mint a többi vonzó erô. Ezt is lágy minták esetében használjuk. Hátránya, hogy a szennyezô réteg többnyire nem összefüggô, és emiatt a rendszer könnyen kiesik a visszacsatolásból.

3. "Tapping" eljárás

A nagy amplitúdójú rezonancia eljáráshoz hasonlóan itt is 50-100 nm amplitúdójú rezgéseket végez a z-piezo, de a visszacsatolás úgy van beállítva, hogy a tû minden rezgésnél érintse a felületet. Célszerû nagy rugóállandóval rendelkezô mérôrugót használni. Ez az eljárás azért elônyös, mert a felületen ható erôk nem károsítják a felszínt (nincs vízszintes irányú komponensük), ugyanakkor a felbontás megközelíti a contact eljárással elérhetô felbontást.
 

A mérési eljárások csoportosíthatók aszerint is, hogy a mérés levegôn vagy folyadék közegben történik-e. A folyadékos eljárás speciális mérési elrendezést igényel (pl. folyadék-cellát). A folyadék lehet desztillált víz, vagy biológiai minták esetében a megfelelô puffer. Ezen mérési eljárás elônye, hogy nincs zavaró meniszkusz erô, valamint a tû és a felszín között ható erô nagysága levihetô 10^-8 N alá, ami biológiai mintáknál (pl. fehérjék, DNS, lipid membránok) elengedhetetlen feltétel.
 

Biológiai minták vizsgálata
 

Az AFM biológiai minták vizsgálatára is alkalmas. A biológiai minták tanulmányozásakor szem elôtt kell tartanunk azt, hogy ezek a minták általában sérülékenyebbek, lágyabbak, mint a szervetlenek vagy a mûanyagok. Ezért a tû és a minta között ható erôt viszonylag kis értéken kell tartanunk, hogy a tû ne roncsolja a lágy felszínt, ne "kenje szét" a vizsgálandó objektumokat. Ezt elérhetjük a non-contact mérési eljárások alkalmazásával. Ezen eljárások hátránya az, hogy kisebb felbontás érhtô el velük, mint a contact mode segítségével. Megoldást jelenthet a tapping mode, amellyel viszonylag nagy felbontást kaphatunk a minta roncsolása nélkül.
Azonban nem kell feltétlenül lemondani a contact eljárás elônyeirôl (nagy felbontás, egyszerûség), ugyanis van 0000lehetôség arra, hogy a tû és a minta között ható erôt a kellô értékre lecsökkentsük. Ehhez a mérési paraméterek közül a Set Point áram értékét kell a szokásos 0, -5nA-nél alacsonyabbra, -15, -20nA-re beállítanunk. Ilyenkor a függôleges (z-irányú) piezo-feszültség is lecsökken. Ez akkor jelenthet problémát, ha valamilyen külsô hatás (hômérséklet-ingadozás, a minta esetlegesen nagy mértékû felületi egyenetlensége) miatt a Z Piezo feszültség értéke ingadozik, és eléri a minimális -220 V-ot, amikor a mérô rendszer "kiesik a visszacsatolásból" , "kiakad". Mégis, ez a módszer gyakran célravezetô.
Biológiai mintákat gyakran folyadék alatt célszerû vizsgálni. Sokszor a mintánk miatt nem is nélkülözhetô valamilyen alkalmas puffer jelenléte. További elônye a folyadékban történô mérésnek a zavaró kapilláris erô kiküszöbölése (ez akkor jelentkezik, ha a száraz minta felületére pára csapódik, lásd a ábrát).
Sok információt nyerhetünk a mintáról a Lokális Erô Spektsoszkópia (Point Spectroscopy) alkalmazásával. Point Spectroscopy segítségével mérhetjük például egy sima, kemény felületre lekötött biológiai objektum (pl. fehérje) viszko-elaszticitását, azaz a belenyomódó tûvel szembeni mechanikai ellenállását különbözô pufferekben (ahol a fehérje különbözô konformációkat vesz fel).
 

Néhány alkalmazás

LB-filmek
 

Szilicium hordozóra felvitt LB-film  

Fehérjék

"Spenót keménytojással" (Két hôsokk-fehérje csillám felszínén)

 
 

DNS


 
 
 

Virális cirkuláris DNS-szál     Vörös vértestek

 
 
 

Sejtek
 
 
 

Limfoblaszt sejt (A kép jobb felsô részén)

 
Ellenôrzô kérdések

- Mik az AFM fôbb részei?
- A mérôrugóknak milyen tulajdonságokkal kell rendelkezniük?
- Hogyan detektáljuk a mérôrugó elhajlását?
- Milyen típusú scannereket ismertél meg? Hogy mûködnek? Mi a feladatuk?
- Milyen erôk hatnak a tû és a minta között? Hogy történik az eredô erô mérése?
- Mi a különbség a Contact illetve a Noncontact mérési eljárás között?
- Mik a Tapping eljárás elônyei?
- Mire kell vigyázni a biológiai minták vizsgálatakor?